Jeudi 15 Décembre 2022
Hicham Sekkouri Alaoui présentera ses résultats sur l’étude du mécanisme d’auto-assemblage du principal système de partition de l’ADN bactérien
Résumé :
Mon projet concerne l’auto-assemblage du complexe nucléoprotéique ParBS impliqué dans la partition des chromosomes et des plasmides à bas nombre de copies chez la plupart des bactéries. Des découvertes récentes ont révélé que ce système est catalysé par la liaison du CTP à la protéine ParB de liaison au centromère parS (Osorio-Valeriano et al., 2019; Soh et al., 2019). En effet, cet événement est essentiel au positionnement intracellulaire précis de milliers de ParB autour de quelques sites centromères parS. Cependant, le mécanisme d’auto-assemblage de ces structures en forme de gouttelettes reste spéculatif (Guilhas et al., 2020a), et un modèle physico-mathématique récent prédit un effet du surenroulement de l’ADN sur le profil de liaison de ParB (Walter et al., 2021). Basés sur des expériences de séquençage ChIP, les principaux objectifs de mon doctorat sont (i) de tester in vivo cet effet sur le modèle d’auto-assemblage de ParB et (ii) d’éclaircir le mode de propagation de ParB à partir de parS.
Pour ce faire, j’ai rassemblé un ensemble de souches reflétant une large gamme de densité de surenroulement d’ADN (σ). En effet, j’ai observé qu’E. coli topA, E. coli wt, S. thy LT2 wt et LT2 gyrB offrent une variation σ de l’ADN libre qui va de -0,038 à -à 0,026. Dans cette gamme, le résultat du profil de liaison ParB sur le plasmide F est fidèlement conservé ce qui confirme la pertinence des prédictions. Pour engendrer la condition de surenroulement nul, j’ai généré des souches bactériennes portant des plasmides F linéarisés par télomérisation (Deneke et al., 2000) dans la région de propagation ParB. Contrairement à la chute de signal immédiate attendue, les résultats du séquençage ChIP indiquent que la variation de densité de superenroulement de l’ADN n’affecte pas le schéma de liaison à l’ADN ParB jusqu’à la position des télomères. Une telle robustesse soutient l’idée d’un réseau synergique d’interactions ParB centré sur parS (Debaugny et al., 2018; Sanchez et al., 2015).
La soutenance de thèse sera précédée d’un séminaire : Dr Olivier Espeli (Collège de France, Paris) : « Strategies allowing E. coli associated with Crohn’s disease to survive within immune cells »
Equipe GeDy
Vendredi 4 Novembre 2022
Alix Meunier présentera ses résultats sur l’étude de la coordination entre croissance et cycle cellulaire chez l’espèce Escherichia coli.
Résumé :
Comme tous les êtres vivants, les bactéries ont besoin de se reproduire pour survivre à long terme. La plupart des bactéries le font par fission binaire, y compris l’organisme modèle Escherichia coli. Sous sa simplicité conceptuelle, la fission binaire apparaît comme un processus moléculaire complexe. Elle implique de multiples mécanismes de base, qui sont hautement conservés parmi les souches d’une même espèce. L’efficacité de ce programme de prolifération, c’est-à-dire sa rapidité et son faible taux d’échec, repose également sur une forte coordination spatio-temporelle de tous les évènements du cycle cellulaire. Cela est particulièrement remarquable dans le cas des bactéries à croissance rapide qui sont capables de gérer plusieurs yeux de réplication en simultané. Depuis les années 60, les études de physiologie bactérienne travaillent au décryptage de ce réseau moléculaire et la définition de modèles généraux décrivant la coordination du cycle cellulaire. Les progrès récents des techniques d’analyse unicellulaire offrent de nouvelles perspectives. Je suis particulièrement intéressée par la diversité phénotypique que l’on retrouve entre des souches appartenant à une même espèce. Au cours de ma thèse, j’ai appliqué une approche de biologie cellulaire comparative pour tester les corrélations existantes entre les paramètres phénotypiques liés au cycle cellulaire. Grâce à la microscopie optique, au suivi de la densité optique des cultures, à la PCR digitale en gouttelettes et à la cytométrie en flux, j’ai caractérisé précisément une série de phénotypes, à savoir la morphologie, les proportions de cellules en ségrégation et en division pendant la croissance exponentielle, le taux de croissance de la population, la durée des périodes du cycle cellulaire, et cela pour huit souches différentes d’Escherichia coli. Mes données suggèrent des différences de corrélation entre taille cellulaire et croissance cellulaire, impliquant des différences de volume à l’initiation de la réplication de l’ADN entre souches d’une même espèce bactérienne. Elles révèlent également une remarquable conservation des durées de réplication du matériel génétique et de division cellulaire entre ces souches. La période de ségrégation des réplicats chromosomiques semble également relativement invariable pour une souche donnée dans différentes conditions de croissance, mais sa durée varie de souche à souche. Ainsi, une diversité dans le contrôle du moment d’initiation, mais aussi dans la durée de certains évènements du cycle cellulaire peut être identifiée entre souches partageant plus de 95% d’identité entre les gènes de leur génome cœur. Ces observations pourraient permettre par la suite d’identifier de nouveaux facteurs impliqués dans le contrôle du cycle cellulaire bactérien.
La soutenance de thèse sera précédée de d’un séminaire : Pr Erick Denamur (Universités Paris Cité et Sorbonne Paris Nord) : « Population genetics of Escherichia coli natural isolates. »
Equipe GeDy
Vendredi 23 Septembre 2022
Luis Orenday Tapia présentera ses résultats sur l’étude des mécanismes de biogénèse et de maintenance de la membrane externe des bactéries Gram négatives.
Résumé :
Les bactéries Gram-négatives comptent de nombreux agents pathogènes multirésistants. Leur enveloppe multicouche est composée d’une membrane interne (IM) et d’une membrane externe (OM) séparées par le périplasme contenant le peptidoglycane (PG). L’OM forme une barrière semi-perméable qui empêche l’entrée de nombreux produits chimiques. Les lipoprotéines et les protéines intégrales de l’OM (OMPs) sont des composants cruciaux de l’OM impliqués dans l’échange de nutriments, la sécrétion de molécules toxiques et l’interaction avec l’environnement. L’OM contient des lipopolysaccharides (LPS) dans le feuillet externe et des phospholipides dans le feuillet interne. Tous les composants de l’OM sont synthétisés dans le cytosol ou au niveau de l’IM et sont acheminés vers l’OM par des voies de transport spécifiques. Parmi celles-ci, le complexe BAM (β-barrel assembly machinery) replie et insère les OMPs dans l’OM. L’assemblage de certaines OMPs nécessite le module de translocation et d’assemblage (TAM) dont l’activité demeure mal comprise. L’accumulation d’OMPs dépliées dans le périplasme déclenche l’activation de la réponse au stress de l’enveloppe médiée par σE. Le facteur σE régule un certain nombre de gènes, augmentant le niveau des sous-unités de BAM. Alors que les voies de biogénèse de l’enveloppe ont été bien décrites ces dernières décennies, la manière dont ces processus sont coordonnés au cours du cycle cellulaire reste peu connue. Ce projet de thèse visait à étudier la régulation du complexe BAM en identifiant ses interactions dans l’enveloppe de l’entérobactérie Escherichia coli. Nous avons mis en place une approche de protéomique quantitative qui a permis de décrire l’interactome de BAM. Parmi les interactants putatifs de BAM, nous avons identifié deux protéines clés de l’enveloppe, la lipoprotéine DolP/YraP associée à la division cellulaire et à la réponse au stress et la protéine de transport TamB ancrée dans l’IM. Lors de ma soutenance de thèse du 23 septembre 2022, je présenterai les résultats que j’ai obtenus sur la façon dont l’interaction entre BAM et DolP ou TamB contribue à former et à préserver une barrière semi-perméable efficace qui protège les bactéries contre le stress et les molécules nocives, telles que les antibiotiques.
La soutenance de thèse sera précédée de 2 séminaires de 30 minutes :
– Peter van Ulsen (Vrije Universiteit, Amsterdam) : « Autotransporter Hbp as model, vehicle and target »
– Alessandra Polissi (Università di Milano) : « Peptidoglycan remodeling as a strategy to survive outer membrane stress in Escherichia coli «
Equipe Raffaele Ieva
Jeudi 24 Mars 2022
Valentin Quèbre présentera ses résultats sur l’étude des complexes ADN/Protéines impliqués dans la ségrégation de l’ADN bactérien.
Résumé :
La ségrégation des chromosomes et des plasmides à bas nombre de copies chez les bactéries est basée sur un mécanisme actif de positionnement. Il repose sur des systèmes de partition qui assurent la répartition intracellulaire des réplicons afin qu’ils soient transmis de façon fidèle à la descendance. Ils font intervenir trois partenaires encodés par la molécule à ségréger. Une protéine de liaison à l’ADN (ParB) s’assemble en un complexe de partition autour d’une séquence centromérique (parS). Une protéine NTPase, interagissant avec le complexe de partition, est responsable de l’activité de ségrégation et du positionnement du complexe de partition et ainsi du plasmide. Mon projet de thèse vise d’abord à approfondir le mécanisme d’assemblage du complexe de partition du système majoritaire de type I des plasmides F et pESBL et ensuite, à déchiffrer le mécanisme global de partition du système atypique de R388 récemment découvert, n’utilisant pas de NTPase codée par le plasmide pour assurer son positionnement.
Ainsi, mon projet s’articule en trois parties. (i) Comprendre par une approche mutationnelle le mécanisme d’initiation de l’auto assemblage de l’ensemble des ParB du plasmide F en un complexe de haut poids moléculaire dynamique, autour de parS. (ii) Identifier les partenaires du système de partition du plasmide pESBL, caractériser in vitro l’interaction de ParB avec parS et déterminer par une étude in silico, le groupe auquel il appartient. (iii) Identifier le rôle des différents domaines de la protéine de liaison à l’ADN StbA du plasmide R388 dans ses activités et caractériser les modalités d’interaction de StbA avec son site spécifique sur le plasmide, par des approches de séquençage à haut débit et de biochimie, pour comprendre l’architecture du complexe de partition.
Cette étude a permis d’approfondir nos connaissances sur la biologie des plasmides portant un système de partition de type I et a mis en lumière les spécificités d’interactions ADN/protéines d’un système atypique, ouvrant la voie à la compréhension de son mécanisme de stabilisation.
Equipe Gedy – Jean-Yves Bouet et François Cornet
Vendredi 17 Décembre 2021
Mickaël Maziero présentera ses résultats sur la caractérisation de voies 
d’induction de la compétence pour la transformation naturelle chez Streptococcus pneumoniae.
Résumé :
Streptococcus pneumoniae est une bactérie pathogène impliquée dans de multiples pathologies comme les pneumonies, otites et méningites. Elle est responsable selon l’OMS de plusieurs millions de morts par an. Cette bactérie pose de nombreux problèmes de par son adaptabilité reposant sur sa capacité à transformer naturellement. Ce mécanisme permet de récupérer de l’ADN exogène dans le milieu extérieur, de l’internaliser et le recombiner le cas échéant avec son chromosome, lui permettant ainsi d’acquérir de nouveaux traits génétiques. Cette capacité n’est pas permanente et prend place pendant que la bactérie est dans un état physiologique particulier appelé compétence. L’opéron comCDE est l’élément central du déclenchement de la compétence. Le gène comC code pour un peptide sécrété capable d’activer le système à deux composants ComD/E qui va en cascade induire la transcription de comCDE. Ce système forme donc une boucle auto-catalytique positive d’induction de gène. De ce fait, l’ensemble de la population bactérienne bascule en compétence en un court laps de temps et de manière coordonné grâce au peptide phéromone produit par comC. La compétence de S. pneumoniae est donc un état propagatif dont le déclenchement est extrêmement (finement) régulé. Cependant, les stimuli extérieurs et les voies de signalisation moléculaires contrôlant le déclenchement de la compétence restent encore mal caractérisés. Les travaux de cette thèse ont pour but d’implémenter ces connaissances. Nous avons ainsi mis en évidence que des températures de l’ordre de celle de la fièvre induisent la compétence. Nous avons caractérisé la voie moléculaire reliant ce stress à l’opéron comCDE. Nous avons également montré que cette voie d’induction n’est pas la seule et qu’il existe au moins une seconde voie de signalisation indépendante faisant intervenir un système toxine/antitoxine. L’existence de voies régulatrices multiples convergeant vers l’opéron comCDE suggère fortement que la compétence est un régulon général de réponse aux stress.
Equipe de Patrice Polard
Mercredi 15 Décembre 2021
Yiying Yang présentera ses résultats sur l’étude des mécanismes de la biogenèse et du maintien de la membrane externe chez les bactéries Gram-négatives.
Résumé :
Les bactéries à Gram négatif comprennent un certain nombre d’agents pathogènes animaux redoutables qui sont particulièrement résistants aux thérapies antibiotiques grâce à la fonction protectrice de leur enveloppe bactérienne. L’enveloppe des bactéries à Gram négatif est composée d’une membrane interne (MI) et d’une membrane externe (ME), séparées par un espace, le périplasme, contenant le peptidoglycane (PG). Le feuillet externe de la bicouche de la ME contient des lipopolysaccharides (LPS) qui forment unebarrière imperméable à certaines molécules toxiques, tels que les détergents ou des petites molécules hydrophobes. Les nutriments sont transportés par les protéines (OMP) de la ME. D’autres OMP remplissent des fonctions de biogenèse de l’enveloppe, notamment l’assemblage des OMP et des LPS. Les OMP sont assemblées dans la ME par le complexe d’assemblage en tonneau bêta (BAM), un hétéro-pentamère contenant l’OMP essentielle BamA et quatre lipoprotéines BamBCDE. L’assemblage du LPS nécessite une autre OMP essentielle, LptD, qui s’associe de manière stable avec la lipoprotéine LptE. Un assemblage défectueux des OMP provoque un stress de l’enveloppe et rend les bactéries Gram-négatives sensibles aux antibiotiques et aux détergents. Le complexe BAM représente donc une cible prometteuse pour le développement de nouveaux antibiotiques.La fonction moléculaire du complexe BAM dans la biogénèse des ME est mal comprise. En utilisant une stratégie de spectrométrie de masse quantitative, le laboratoire d’accueil a récemment identifié deux nouveaux interacteurs putatifs du complexe BAM, les lipoprotéines DolP (anciennement YraP) et BilB, toutes deux de fonctions inconnues. L’objectif de ce travail de thèse était de caractériser les rôles respectifs de DolP et BilB au sein du complexe BAM.
Equipe de Raffaele Ieva
Lundi 13 Décembre 2021
Elise Courtais présentera ses résultats sur l’étude du blocage de la division induit lors du processus de compétence pour la transformation génétique chez Streptococcus pneumoniae.
Résumé :
La transformation génétique naturelle est un mécanisme programmé de transfert horizontal de gènes chez les bactéries. Elle requiert l’entrée des cellules dans un état physiologique transitoire appelé compétence, au cours duquel un complexe multiprotéique associé à la membrane assure la capture d’ADN exogène, son internalisation et son intégration par recombinaison homologue dans le génome. Chez le pathogène humain majeur Streptococcus pneumoniae, cette machinerie est assemblée au site de division de la cellule. La compétence se développe chez cette espèce dans l’ensemble de la population et provoque un arrêt de croissance, suggérant un lien fonctionnel de la compétence avec le cycle cellulaire. Au cours de ma thèse, je me suis intéressée au mécanisme de cet arrêt de croissance.
J’ai d’abord testé l’implication de différents composants de l’appareil de transformation localisés au site de division dans le retard de croissance observé lors de l’induction de la compétence. Ces recherches m’ont permis de mettre en évidence que l’assemblage du pilus de transformation, responsable de la capture d’ADN exogène, entraine l’agrégation des cellules compétentes. Mes résultats suggèrent que cette agrégation joue un rôle dans le fratricide, un processus spécifique de S. pneumoniae au cours duquel les cellules compétentes développent la capacité à « tuer » des cellules sœurs non-compétentes.
J’ai par ailleurs adapté une technique de microscopie à super-résolution, dans le but, à terme, de comprendre à l’échelle moléculaire et in cellulo le mécanisme de d’inhibition de la division des cellules compétentes. J’ai développé des outils permettant des acquisitions en 3D-PALM (PhotoActivated Localization Microscopy), une technique de microscopie basée sur la localisation de molécules uniques avec une résolution d’environ 50 nm, pour déterminer la structure de l’anneau de division FtsZ dans les 3 dimensions. Pour étudier le devenir de l’anneau FtsZ aux cours des différentes étapes du cycle cellulaire, les paramètres morphologiques de chaque cellule ont été mesurés à partir d’images en contraste de phase. Mes premiers résultats montrent que les protéines FtsZ forment un anneau hétérogène dont les dimensions varient au cours du cycle cellulaire, allant de de 300 à 700 nm de diamètre tandis que l’épaisseur (~110 nm) et la profondeur (~100 nm) restent constants. La présence de zones de forte intensité de fluorescence et de zones de moindre intensité indique que les protéines ne sont pas réparties de façon homogène dans l’anneau mais sont regroupées sous forme de clusters de densité variable.
Equipe de Patrice Polard
Jeudi 9 juillet, 14 h
Cyril Moulin, lauréat d’une bourse de thèse de la Ligue contre le cancer et de la Fondation pour la Recherche Médicale, présentera ses résultats sur l’étude du rôle des sous-unités principales et régulatrices de la translocase de la membrane interne TIM23 dans l’import des protéines mitochondriales.
A cette occasion, Maria Bohnert de l’Université de Münster et Thomas Becker de l’Université de Bonn présenteront le mardi 6 juillet 2021 à partir de 14h30 via zoom leurs travaux sur la biogenèse et la dynamique des organelles cellulaires (CBI Seminar Bohnert and Becker )
Equipe de Raffaele Ieva
